От идеи до масштаба: плавный переход от колбы к настольному биореактору

Переход от колбы к настольному биореактору — один из самых критичных этапов масштабирования. По оценкам специалистов, до 70% провалов первого масштабирования приходится именно на этап 2–10 л.

Для клеток млекопитающих переход от колбы к биореактору — одна из наиболее уязвимых фаз всего процесса разработки. У них нет клеточной стенки, мембрана чувствительна к гидродинамическому сдвигу и воздействию микроджетов, возникающих при лопании пузырьков. Поэтому масштабирование таких культур принципиально сложнее, чем масштабирование бактерий, у которых есть прочная клеточная стенка и которые устойчивее к механическому воздействию.

По данным отраслевой статистики, 60–75% неудачных попыток масштабирования происходят именно на этом этапе. При этом в колбе культура может демонстрировать отличные показатели: плотность 1,5–2 млн клеток/мл, жизнеспособность 95–98%, стабильный метаболизм. Но уже через 12–24 часа после переноса в биореактор жизнеспособность может снижаться до 60–75%, скорость роста — уменьшаться в два-три раза, а продуктивность по рекомбинантному белку — существенно падать.

Причина такого разрыва — не в изменении биологии клетки. Генетика линии остаётся той же, состав среды не меняется, стерильность соблюдается. Проблема в том, что колба и биореактор — это принципиально разные физические среды для клетки. Биореактор — не просто «колба большего объёма».

Причина — в смене типа среды: в колбе клетки находятся в пассивной среде, где газообмен идёт только за счёт диффузии, а в биореакторе среда становится активно управляемой — с перемешиванием, аэрацией и гидродинамическими градиентами.

Понимание этой разницы и грамотный алгоритм адаптации штамма позволяют пройти переход без потери жизнеспособности и продуктивности.

Классические жидкие среды — MEM, DMEM, RPMI, Ham's, IMDM, McCoy's — хорошо знакомы большинству лабораторий.

Для производства вакцин применяются бессывороточные среды и подпитки — жидкие и сухие, от 1 до 200 л. Они покрывают потребности клеток NECK293, Vero, PK15, BHK, MDBK, гибридом и адгезионных культур с низким содержанием сыворотки.

Для клеточной и генной терапии предназначены серии HIPP (T-клетки, NK, CAR-T, CIK, CAR-NK-92, CD34+, NK-92, K562, Jurkat) и Celer (производство AAV в HEK293 и HEK293T в суспензии). Для наработки антител — серия Eden для линий CHO (CHO-K1, CHO-ZN, HORIZON, CHO-S, CHO-DG44 и др.), исключительно в сухом формате от 1 до 200 л.

Для приготовления буферов и сред необходима вода 2-го и 3-го типов. В портфеле «Диазм» представлены системы BWT (bestclear) и линейка AL (AL, AL Double, AL Plus, EDI, Supreme S18, Pure, AL Mobile).

Сухие культуральные среды следует разводить на воде первого типа — максимальной степени очистки, с минимальным содержанием солей, органических соединений, бактерий и эндотоксинов. Если система очистки воды долго не использовалась, первые 50–100 мл рекомендуется слить. Воду первого типа нельзя длительно хранить: лучше использовать свежеполученную. Также необходимо регулярно менять предфильтры и картриджи системы водоподготовки — в старых картриджах могут формироваться биоплёнки бактерий и грибов, которые становятся дополнительным источником загрязнений, в том числе эндотоксинов.

Статичное культивирование. Клетки зафиксированы на дне посуды. Растворение O₂ идёт за счёт диффузии, возникают градиенты O₂/CO₂ и нутриентов/отходов.

Суспензионное культивирование. Клетки распределены в объёме жидкости. Увеличено соотношение поверхности к объёму — лучше растворение O₂, есть перемешивание, нет градиентов.

Именно переход от статичного к суспензионному типу и лежит в основе масштабирования. Перемешивание позволяет увеличить объём культуры и эффективность процесса: клетки более равномерно распределяются по объёму, улучшается контакт среды с газовой фазой, повышается эффективность растворения кислорода и уменьшается образование выраженных градиентов питательных веществ и метаболитов.

На газообмен в колбе влияет множество факторов:

• форма колбы — Эрленмейера, Фернбаха, Томсона;
• наличие отбойников — увеличивают турбулентность;
• тип крышки — фольга, ватная или целлюлозная пробка, фильтр;
• объём наполнения — обычно 10–20% от номинала;
• скорость перемешивания на шейкере;
• амплитуда и диаметр орбиты шейкера.

Чем больше диаметр колбы, тем больше площадь соприкосновения жидкости с газовой фазой, но тем больше места она занимает в шейкере и тем интенсивнее испарение — а испарение влияет на водно-солевой баланс среды и может приводить к изменению pH. Отбойники создают дополнительную турбулентность и улучшают газообмен, но одновременно повышают механическую нагрузку на клетки.

Максимальное наполнение колбы, как правило, около 30% номинального объёма. Чаще используют до 25%, а в некоторых процессах — около 10%. Чем меньше объём жидкости в одной колбе, тем меньше конечный выход с одной единицы посуды.

Скорость перемешивания непосредственно влияет на газообмен. Высокие скорости подходят для бактерий, дрожжей и грибов, но для эукариотических клеток этот фактор лимитирующий: бесконечно увеличивать скорость нельзя из-за механического стресса.

Амплитуда перемешивания — ещё один важный параметр. Универсальный вариант — около 25 мм (для колб до 2 л и для прокариот). Амплитуда около 50 мм применяется для колб более 2 л и для эукариотических клеток.

Уникальная особенность шейкеров Labwit — плавная регулировка амплитуды перемешивания, доступная пользователю. В приводе установлены противовесы; при помощи специального ключа пользователь может изменить их положение и плавно отрегулировать амплитуду в диапазоне приблизительно от 1 до 50 мм. Можно установить, например, 12,5 мм, 19 мм, 25 мм, 50 мм или другое значение. Это позволяет тестировать разные условия без покупки нескольких отдельных шейкеров-инкубаторов.

Стандартные параметры колбы: 100–200 об/мин, постепенный дрейф pH от 7,4 до 6,8, скорость потока менее 0,1 м/с. То есть колба — это среда без гидродинамического стресса.

Есть также небольшой шейкер, предназначенный для установки непосредственно внутрь CO₂-инкубатора. Это удобно, если лаборатория раньше культивировала клетки только в статических условиях и хочет перейти к перемешиванию: вместо покупки большого шейкера-инкубатора можно установить специализированный шейкер внутрь существующего CO₂-инкубатора. Такое устройство специально разработано для работы в условиях повышенной концентрации CO₂ и высокой влажности; панель управления вынесена наружу, а конструкция рассчитана на соответствующие условия эксплуатации. Обычные настольные шейкеры не рассчитаны на длительную работу в такой среде и могут быстро подвергаться коррозии.

Биореактор — это среда с управлением и гидродинамическими градиентами. Клетка циркулирует между зонами с разным стрессом каждые 2–5 секунд.

Именно поэтому прямой перенос оборотов из колбы в биореактор не работает: из-за разной геометрии и типа мешалки одни и те же 120 RPM в колбе и в реакторе дадут совершенно разную нагрузку на клетки.

Даже небольшой настольный биореактор объёмом 3–5 л создаёт сложную гидродинамическую картину, к которой культура, выращенная в колбе, изначально не подготовлена. Критических факторов три.

Первый — профиль скоростей возле мешалки. При скорости 200–250 об/мин в зазоре между лопастью и стенкой реактора локальная скорость потока может достигать 1,5 м/с. Для сравнения: в колбе максимальная скорость жидкости возле стенки — около 0,1 м/с. Сдвиговое воздействие может быть выше в десятки раз.

Второй — газовый спарджер и микроджеты. Пузырьки поднимаются к поверхности и лопаются несимметрично: верхняя часть разрушается быстрее нижней. В результате формируется узкая струя, направленная вглубь жидкости — микроджет. Его скорость может достигать 5–10 м/с, а глубина воздействия — 100–200 мкм. Этого достаточно для повреждения липидного бислоя мембраны клеток, находящихся вблизи поверхности.

Третий — циркуляция клеток между зонами. В колбе клетка находится в относительно однородных условиях. В биореакторе она постоянно перемещается между зоной покоя у стенки, зоной высокого сдвига у лопасти, областью пузырьков у спарджера и поверхностью, где образуются микроджеты. Полный цикл занимает 2–5 секунд. Клетка не успевает адаптироваться к каждому состоянию, повреждения накапливаются.

Главный принцип: DO — стабильность важнее абсолютного значения.

Большинство распространённых линий — CHO, HEK-293, BHK — комфортно растут при DO 30–50%. Резкое падение DO ниже 15–20%, даже кратковременное, вызывает метаболический стресс: клетки переключаются с аэробного дыхания на анаэробный гликолиз, накапливается лактат, снижается pH, ингибируется синтез рекомбинантного белка.

Особенно опасен такой сценарий в начале культивирования. Если одновременно включить мешалку и аэрацию, потребление кислорода в первые минуты может превысить скорость его поступления — в первые 10–15 минут возможен провал DO до 10–15%. При этом датчик DO в верхней части реактора может показывать 40%, тогда как в придонной зоне или внутри агрегатов будет локальная гипоксия.

На графиках ez2-Control хорошо видно, как DO падает с 100% до целевого уровня по мере роста культуры, и система сама подстраивает подачу газов. Нестабильный профиль DO — сигнал о проблемах с аэрацией или перемешиванием.

Важное ограничение: при диаметре агрегата более 200 мкм в центре возникает гипоксия даже при DO 40% в объёме. Поэтому контроль размера агрегатов не менее важен, чем контроль DO. Это особенно критично для культур, склонных к образованию агрегатов, — например, мезенхимальных стволовых клеток или отдельных линий CHO.

Зона ввода щёлочи — критичная зона биореактора. При добавлении щёлочи pH локально поднимается до 8,5, через 30 секунд падает до 7,8, через 60 секунд — до 7,2. Клетка, проходя через эту зону, испытывает стресс.

Оптимальный диапазон pH для большинства эукариотических линий — приблизительно 6,9–7,4. Отклонения в обе стороны вызывают специфические виды стресса.

Самые важные метаболиты — глюкоза, лактат, аммоний.

• При снижении pH ниже 6,8 возникает лактатный стресс. Причины — избыток глюкозы в среде (особенно при высокой плотности) и гипоксия, усиливающая анаэробный гликолиз. Лактат дополнительно снижает pH и формирует замкнутый круг. При высокой концентрации лактата жизнеспособность падает даже после коррекции pH: лактат проникает в клетку и закисляет цитозоль.
• При повышении pH выше 7,6 возникает аммиачный стресс. Аммиак образуется при деградации глутамина и метаболизме аминокислот, проникает в клетку, нарушает внутриклеточные процессы и вызывает набухание клеток.

В колбе лактат и аммиак накапливаются постепенно, и клетка успевает адаптироваться. В биореакторе, особенно при автоматической подпитке или резком включении контура регулирования pH, могут формироваться локальные пики. Например, при подаче концентрированного раствора щёлочи в точке ввода на короткое время возникает локальная зона с pH порядка 8,2–8,5. При скорости перемешивания около 200 об/мин полная гомогенизация объёма занимает порядка 40–60 секунд — за это время клетки в зоне высокой локальной концентрации щёлочи могут получить щелочной шок с повреждением мембраны и активацией протеаз.

Практическая рекомендация — делать зону нечувствительности pH-контроллера шире. Вместо стандартных ±0,05 единицы использовать около ±0,2, чтобы уменьшить частоту подачи щёлочи примерно до одного раза в 5–7 минут.

Для контроля метаболитов используются анализаторы (Китай, Россия) и датчики: глюкоза — GlucoSense (0,5–25 г/л), pH — EasyFerm Plus (0–14).

Ключевой тезис: пузырьки опаснее мешалки для клеток млекопитающих.

Многие исследователи в первую очередь обращают внимание на обороты мешалки и стараются максимально их снизить, но недостаточно учитывают тип спарджера и режим подачи газа. Между тем именно пузырьки и образующиеся при их разрушении микроджеты способны существенно снижать жизнеспособность культуры в первые часы после запуска биореактора.

Когда пузырёк диаметром 1–3 мм достигает поверхности, он лопается несимметрично: верхняя часть разрушается быстрее нижней, контактирующей с жидкостью. Формируется узкая струя, направленная сверху вниз. Её скорость может достигать порядка 10 м/с, а область воздействия — распространяться на глубину до 200 мкм от поверхности. Такой энергии достаточно для повреждения липидного бислоя клеточной мембраны.

Типы спарджеров:

• кольцевой — отверстия 1–2 мм, даёт крупные пузырьки, меньше пены;
• микропористый — из спечённого металла или керамики, даёт мелкие пузырьки, лучше газообмен, но больше пены и сдвигового стресса.

При использовании кольцевого спарджера с отверстиями около 1 мм образуются крупные пузырьки. При таком режиме жизнеспособность клеток CHO может существенно снижаться в первые часы даже при небольшой скорости мешалки — около 150 об/мин. Замена кольцевого спарджера на микропористый (поры 10–50 мкм, спечённый металл или керамика) значительно уменьшает падение жизнеспособности: такие спарджеры дают пузырьки 50–150 мкм, которые либо успевают раствориться в объёме, либо достигают поверхности с меньшей кинетической энергией.

Практическая рекомендация для этапа адаптации — начинать со скорости мешалки порядка 150–180 об/мин при использовании мешалки типа «морской винт» и микропористого спарджера с размером пор 10–50 мкм.

Pluronic F-68. В культуральную среду можно добавлять Pluronic F-68 в концентрации 0,1–0,5%. Он уменьшает поверхностное натяжение на границе раздела фаз и снижает негативное воздействие лопающихся пузырьков. Важно: перед использованием в биореакторе проверьте его влияние на культуру в колбе в течение 48 часов — особенно если это новая партия или новая клеточная линия. Разные партии реагента теоретически могут отличаться по содержанию примесей, а чувствительные линии могут по-разному на них реагировать.

Современные датчики для биореакторов:

• Общая плотность клеток, Dencytee — измерение при 880 нм (NIR), нечувствительно к изменениям цвета среды, CIP, стерилизация паром 135 °C, автоклавирование.
• Плотность жизнеспособных клеток, Incyte — на измерения не влияют изменения в среде, микроносители, мёртвые клетки или клеточные остатки; диапазон проводимости 0,5–100 мСм/см.
• Растворённый кислород, VisiFerm DO — 0–62,85% по объёму или 0–300% по насыщению; CIP, стерилизация паром 135 °C, автоклавирование.
• pH, EasyFerm Plus — 0–14; CIP, стерилизация паром 135 °C, автоклавирование.
• Глюкоза, GlucoSense — 0,5–25 г/л; CIP, стерилизация паром 135 °C, автоклавирование.

Датчик GlucoSense устанавливается непосредственно в биореактор и позволяет непрерывно отслеживать концентрацию глюкозы без постоянного ручного отбора проб.

Критерии качества инокулята для клеток млекопитающих:

• жизнеспособность ≥95% (трипановый синий / автоматический анализатор);
• плотность 0,3–0,5×10⁶ кл/мл (камера Горяева / автоматический анализатор);
• лактат ≤2,5 ммоль/л (биохимический анализатор / тест-полоски);
• аммиак ≤4 мМ (биохимический анализатор);
• размер агрегатов ≤150 мкм (микроскоп с окуляр-микрометром).

За 4–6 часов до сбора инокулята аккуратно пропипетировать культуру 10–15 раз крупной пипеткой (10 мл). Движения должны быть плавными, без образования пузырьков и пены.

Как работает «тренировка» сдвигом. Контролируемый механический сдвиг при пропипетировании запускает защитные механизмы клетки, но недостаточен для повреждения. В ответ клетки перестраивают цитоскелет: полимеризуются актиновые филаменты, укрепляются связи между мембраной и цитоскелетом через белки анкирин и спектрин. После процедуры жизнеспособность может временно немного снизиться, а затем восстановиться. Предварительная адаптация повышает устойчивость клеток к сдвигу в биореакторе.

Физиологическое состояние инокулята. Собирать инокулят желательно в ранней экспоненциальной фазе. Для CHO и HEK-293 это плотность около 0,3–0,5 млн клеток/мл. Для медленно растущих культур (некоторые первичные клетки) — 0,15–0,25 млн клеток/мл. Жизнеспособность — не ниже 95%.

Метаболический профиль. За 2 часа до сбора измерьте лактат и аммиак. Ориентиры: лактат ≤2,5 ммоль/л, аммиак ≤4 ммоль/л. Если выше — перенос лучше отложить и провести дополнительную смену среды. Клетки, уже находящиеся в выраженном метаболическом стрессе, гораздо хуже переносят дополнительную нагрузку при переходе в биореактор.

Объём инокулята — 10–20% от рабочего объёма биореактора. Меньше — лаг-фаза может растянуться до 12–18 часов. Больше — возрастает начальная нагрузка на систему аэрации.

Поэтапный старт:

• 0 мин — 180 об/мин, без газа;
• 60 мин — аэрация 0,05 → 0,2 vvm;
• 120 мин — замыкание pH (±0,2);
• 150 мин — подкормка после 50% от максимальной плотности;
• 180+ мин — выход на рабочий режим.

Поэтапный запуск — ключевой принцип. Каждый следующий параметр вводится только после стабилизации предыдущего: клетке сложно одновременно адаптироваться к сдвигу, изменению газообмена, колебаниям pH и изменению режима питания.

• Шаг 1. Мешалка без аэрации. 150–180 об/мин, 45–60 минут. Цель — гомогенизировать среду. Контроль: падение жизнеспособности не более 3–5%. Если больше — снизить обороты на 20–30% и проверить через 30 минут.
• Шаг 2. Аэрация. Только после стабилизации жизнеспособности. Начать с 0,05 vvm, плавно увеличить до 0,15–0,2 vvm в течение 60 минут. Не использовать дополнительное обогащение кислородом — резкий рост парциального давления O₂ может вызвать окислительный стресс и повреждение митохондрий.
• Шаг 3. Замыкание pH. Только после стабилизации DO. Для клеток млекопитающих предпочтительна стратегия с бикарбонатным буфером: NaHCO₃ 2–4 г/л с регулированием pH через подачу CO₂. Это плавнее и снижает риск локальных скачков. Если используется NaOH — увеличить зону нечувствительности контроллера до ±0,2 вместо ±0,05. Подача щёлочи — не чаще одного раза в 5 минут.
• Шаг 4. Подпитка. Начинать не раньше, чем культура достигнет 50% от ожидаемой максимальной плотности. Для CHO это ~4–5 млн клеток/мл. Первые 2–3 подпитки — вручную (около 1% объёма каждые 30–40 минут). Через 60 минут после каждой подачи контролировать лактат. Если лактат растёт непропорционально быстро — уменьшить глюкозу или увеличить интервал. Только после стабильного метаболизма переходить на автоматический feeding.

Главный принцип: каждый шаг определяется достижением контрольной точки, а не просто истечением определённого времени.

При выборе биореактора важно избегать избыточности. Разделим опции на две группы:

Обязательно:

• 3 базовых контура (T, DO, pH);
• микропористый спарджер (20 мкм);
• якорная или низкосдвиговая мешалка;
• ручной фидинг шприцем;
• ручное пеноашение.

Для максимального контроля:

• автоматический анализ отходящих газов;
• кольцевой спарджер;
• турбинная мешалка;
• автоматический фидинг с обратной связью;
• автоматическое пеноашение по массе.

Линейка биореакторов включает: классический с мешалкой (250 мл – 20 л), волновой (0,3–25 л), вертикальный с мешками (50–2000 л), стальные стерилизуемые паром (15–20 тыс. л).

Для параллельного культивирования — системы со стеклянными сосудами (500 или 1000 мл, до 16 биореакторов) и с одноразовыми сосудами (500 или 1000 мл, 16-канальная подача).

Геометрия реактора. Оптимальное соотношение высоты сосуда к диаметру — 1,5–2. Такая геометрия уменьшает интенсивность циркуляции клеток через области повышенного сдвига.

Точность настройки. Реактор должен позволять регулировать скорость мешалки с шагом 5–10 об/мин и расход газа с шагом 0,01 vvm. На этапе адаптации это может быть важнее, чем наличие большого количества автоматических функций.

Тип мешалки. Предпочтительны низкосдвиговые: якорные или импеллеры типа «морской винт». На начальном этапе адаптации чувствительных клеток лучше избегать турбинных мешалок Раштона — их конструкция создаёт зоны повышенного сдвига даже при небольшой скорости вращения.

Для сохранения стерильности на всех этапах работы с биореактором применяются:

• спайщики шлангов — AbioWelder 100;
• запайщики шлангов — AbioSealer A100, AbioSealer M500;
• обрезчики шлангов — AbioCutter M100, AbioCutter A100;
• асептические коннекторы NEST — не различаются по типу мама/папа, стандартные модели и мини не взаимозаменяемы. Стандарт: 1/4" (6,4 мм), 3/8" (9,5 мм), 1/2" (12,7 мм), 3/4" (19,1 мм). Мини: 1/8" (3,2 мм), 1/4" (6,4 мм), 3/8" (9,5 мм).

Спайщики и запайщики позволяют в стерильных условиях присоединять к биореактору дополнительные ёмкости (например, бутыли с подпиткой) или отсоединять их, сохраняя закрытость системы. Такие устройства есть в демонстрационном фонде «Диазм» — их можно предоставить лаборатории примерно на неделю для тестирования. Как правило, этого времени достаточно, чтобы понять, насколько оборудование удобно в конкретном рабочем процессе.

Для полноценной работы биореактора необходимо вспомогательное оборудование:

• циркуляционный термостат (чиллер);
• воздушный компрессор;
• кислородный концентратор;
• автоклав для стерилизации биореактора, колб для подкормки и пр.;
• и др.

Циркуляционный термостат (чиллер). Некоторые реакторы предлагают подключать напрямую к лабораторной воде. Однако качество водопроводной воды сильно различается: соли и загрязнения со временем откладываются в змеевике системы охлаждения. Для стабильной работы рекомендуется отдельный чиллер или циркуляционный термостат.

Воздушный компрессор и кислородный концентратор. Компрессор обеспечивает подачу воздуха. Для клеточных культур помимо воздуха могут потребоваться дополнительные газы — для подачи кислорода используется кислородный концентратор.

Автоклав. Для многоразовых стеклянных биореакторов автоклав обязателен: стерилизация самого реактора, колб и ёмкостей для подпитки. При работе с вертикальными автоклавами биореактор и дополнительные ёмкости могут быть тяжёлыми — существуют специальные корзины, подъёмные устройства и лебёдки, чтобы опускать их в камеру без нагрузки на спину оператора.

Отдельно стоит отметить системы автоматизированного заполнения пробирок, например Applitech — установка может быть размещена на лабораторном столе, под ламинаром или в боксе биологической безопасности и подходит для автоматизированной подготовки банков клеток, библиотек штаммов, плазмид, эталонных стандартов и других приложений, требующих асептических условий и соответствия GMP.