Микроматричный анализ

ДНК-микрочипы (microarray) широко применяется для генотипирования. В клинической диагностике микрочипы используются для выявления хромосомных перестроек (аберраций). Общепринятым термином для таких исследований является хромосомный микроматричный анализ (ХМА, chromosomal microarray). С помощью ХМА можно выявить различные хромосомные мутации: изменение плоидности (анеуплоидии, полиплоидии, триплоидии), дупликации и делеции, несбалансированные транслокации, потерю участков гетерозиготности, однородительские дисомии. Разрешение этого метода на много порядков выше обычного кариотипического исследования, выполняемого визуально: соответственно вплоть до 1 п.н. вместо 5-7 млн. п.н.

Микрочип представляет собой твердую стеклянную или кремниевую подложку, к которой прикреплены зонды — короткие олигонуклеотиды длиной 25-60 н. Поскольку последовательность нуклеотидов известна, то гибридизация с ними исследуемой ДНК пациента дает возможность получить данные о его геноме.

Типы микроматричного анализа

Существует два варианта микроматричного анализа: сравнительная геномная гибридизация (array-based comparative genomic hybridization, aCGH) и SNP-генотипирование (single nucleotide polymorphism (SNP) array).

Сравнительная геномная гибридизация

При aCGH выполняется сравнение генома пациента с геномом здорового человека (или группы здоровых людей). Для этого ДНК пациента и референтная ДНК (здоровые люди), измельчаются, денатурируются и окрашиваются разными флуоресцентными красителями (как правило, красным и зеленым). После этого обе ДНК смешиваются, и производится гибридизация с кластерами зондов на подложке. Результаты гибридизации фиксируются при помощи сканера. Поскольку гибридизация обеих ДНК происходит равновероятно (конкурентно), то преобладание флуоресценции красителя пациента над красителем здоровых людей указывает на дупликацию в геноме пациента конкретного участка ДНК (Рис. 1.), а обратная ситуация – о его делеции. Микрочипы для aCGH имеют плотность до 1 млн. зондов, а разрешение составляет до 6 тыс. п.н.

Рис. 1. Этапы сравнительной геномной гибридизации (aCGH). В данном случае анализ выявил у пациента дупликацию определенного геномного локуса.

SNP-генотипирование

В отличие от aCGH для SNP-генотипирования не требуется референтная ДНК. Зонды для SNP короче (25 п.н. вместо 60 п.н. у aCGH), соответствуют участкам генома, которые содержат однонуклеотидные полиморфизмы (точковые мутации), выявляемые в популяции и имеющие клиническое значение. За счет этого микрочипы для SNP-генотипирования более плотные (до 7 млн. зондов), а их разрешение выше – 25 п.н. (до 1 п.н. у кастомных микрочипов, специально разработанных для детекции специфических SNP). Микрочипы для SNP-генотипирования (Рис. 2.), которые разработаны для детекции не только однонуклеотидных полиморфизмов, но и изменчивости копийности определенных участков генома (copy number variation, CNV), называются гибридными (hybrid-SNP arrays).

Рис. 2. Микрочип для SNP-генотипирования.

SNP-генотипирование проще в работе по сравнению с aCGH (Рис. 3.), поскольку не требует манипуляций с референтной ДНК (выполняемых строго одинаково с ДНК пациента). Кроме того, этим методом можно выявить хромосомные перестройки, которые не выявляются aCGH. Например, SNP-генотипирование может дать ответы на следующие вопросы:

• вызвана ли потеря гетерозиготности делециями, или причиной является наличие в геноме пациента длинных смежных участков гомозиготности (long contiguous stretches of homozygosity, LCSH) вследствие близкого родства его родителей?
• получены ли пациентом обе копии хромосомы от одного родителя (однородительская дисомия), или нет?
• является ли пациент гомо- или гетерозиготным по определенному аллелю?
• имеется ли у пациента хромосомный мозаицизм?

Рис. 3. Общее описание сравнительной геномной гибридизации (aCGH array) и гибридного SNP-генотипирования (hybrid-SNP array).